پروتکل های PCR

هنگامی که نمونه های ژنتیکی خود را می گیرید، یکی از اولین مراحل PCR طراحی پرایمرهای مورد نیاز برای انجام واکنش PCR است. در این مطلب ما بطور مفصل در مورد پروتکل های PCR صحبت خواهیم کرد.

طراحی پرایمر

اولین قدم برای پیشبرد یک PCR استاندارد، طراحی پرایمر است. شما باید مشخص کنید که به دنبال کدام قطعه از الگوی DNA هستید تا آن را تکثیر کنید. بنابراین شما باید توالی DNA الگو را بدانید. بانک اطلاعاتی NCBI یک سرور وب است که تمام توالی های DNA شناخته شده را دارد. شما می توانید توالی خود را در آنجا جستجو کنید. پس از آن، شما باید دو پرایمر، پرایمر پیشرو و پرایمر معکوس را طراحی کنید. طراحی پرایمر یک مرحله مهم در پروتکل PCR است. مجموعه پرایمر ها باید قطعه ای را که قصد دارید از الگوی DNA تکثیر کنید، قطعه قطعه کنند. پرایمر پیشرو رو با رشته 3′ به 5′ DNA اتصال پیدا خواهد کرد و پرایمر معکوس با رشته 5′ به 3′ DNA اتصال پیدا خواهد کرد. به شکل زیر نگاه کنید.

بسیاری از مشکلات پروتکل PCR با طراحی اشتباه پرایمر در ارتباط است. رایج ترین اشتباهات در طراحی عبارتند از:

تشکیل پرایمر دایمر
ایجاد ساختار های سنجاق سری به وسیله پرایمر خود اتصال
اتصال غیر اختصاصی

طول پرایمر باید در حدود 18-30 جفت باز باشد، محتوای GC نزدیک به 50٪ و دمای ذوب (TM) بین 55 درجه سانتیگراد و 65 درجه سانتیگراد باشد. برای محاسبه دمای ذوب می توانید از معادله زیر Tm = 2°C (A + T) + 4°C (G + C) استفاده کنید. اگرچه بیشتر DNA پلیمراز های تجاری، محاسبات و دستورالعمل های خاص خود را برای شرایط مختلف ارائه می دهند، چندین بستر وب برای کمک به طراحی پرایمر، مانند http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ در دسترس هستند.

هنگامی که نمونه های DNA خود را با موفقیت تهییه کردید و آغازگرهای پیشرو و معکوس خود را طراحی کردید، میتوانید آزمایش PCR را ادامه دهید.

دئوكسي نوكلئوتيد تري فسفات (dNTPs)

چهار نوکلئوتید تشکیل دهنده قطعهDNA ، بلوک های ساختمانی هستند که توسط DNA پلیمراز برای ساختن رشته های DNAی جدید بکار میروند و باید كنار هم چيده شوند تا رشته مكمل را ايجاد كنند. غلظت مورد نیاز از هر یک از نوکلئوتیدها برای واکنش PCR یکسان و برابر 200 نانو مولار می باشد. برای این منظور از مخلوط های آماده، واجد هر چهار نوکلئوتید که با غلظت های مختلف مثل دو میلی مولار، 10 میلی مولار و 25 میلی مولار موجود است، استفاده می شود. به طور مثال، در یک واکنش 50 میکرو لیتریPCR باید 5 میکرولیتر از مخلوط دو میلی مولار نوکلئوتیدها برای دستیابی به مقدار مورد نیاز در واکنش استفاده کرد.

کاتیون های دو ظرفیتی(یون های منیزیم یا منگنز) و کاتیون های یک ظرفیتی(یون پتاسیم)

یون منیزیم یکی از اساسی ترین اجزا واکنش PCR می باشد. انواع مختلف آنزیمDNA polymerase برای فعالیت خود به این یون نیاز دارند و این یون (عمدتاً به صورت ترکیب کلرید منیزیم(Mgcl2)) برای اتصال پرایمر و قطعه DNA لازم است. این ترکیب گاهی در همان بافر PCR قرار داده می شود ولی از آنجا که برای برخی واکنش های PCR لازم است که غلظت این یون تغییر نماید، این ترکیب به طور جداگانه تهیه و به واکنش PCR افزوده می شود. غلظت بهینه یون منیزیم در واکنش PCR یک تا چهار میلی مولار است. غلظت بالاتر از این مقدار اثر بازدارندگي برروي فعاليت آنزيم Taq پلي مراز دارد و موجب تکثیر قطعاتی غیر از قطعه مورد نظر (قطعات غیر اختصاصی) می گردد و غلظت پایین این یون نیز ممکن است به کاهش کارایی واکنش و کاهش میزان تولید قطعه مورد نظر منجر شود.

Taq DNA polymerase

DNA پلیمراز آنزیمی است که با استفاده از نوکلئوتیدها (مصالح ساختمانیDNA) ، رشته الگو (DNAی مورد مطالعه) و یک قطعه پرایمر قادر به همانند سازی است. DNA پليمراز DNA تک رشته ای را از جهت ‘5 به’3 به عنوان الگو مورد استفاده قرار می دهد و رشته مکمل را در جهت ‘3 به 5’ می سازد.

در مرحله همانند سازی، برای جدا نمودن دو رشته DNA، باید دمای محلول بالا باشد. در ابتدای طراحی PCR از آنزيم کلینو پليمراز I (DNA پليمراز E.coli) استفاده میشد ولی از آنجا که اين آنزيم به حرارت حساس است، پس از هر بار حرارت دادن محيط واکنش تا دمای 94 درجه ی سانتی گراد، افزودن دوباره ی آنزيم تازه به محيط لازم بود. Saiki يکی از مهم ترين کشفيات در اين زمينه را انجام داد و متوجه شد که باکتريهای چشمه های آب گرم (برای مثال باکتری ترموس آکواتیکوس (Thermus aquaticus)) دارای DNA پليمرازهايی هستند که نسبت به حرارت مقاوم بوده و حتی در دمای بالا فعاليت بهتری دارند. این DNA پليمراز که بطور خلاصه Taq پليمراز ناميده می شود در دمای 94 درجه ی سانتی گراد کاملاَ پايدار است و دمای اپتيمم عمل آن نيز 72 درجه ی سانتی گراد می باشد. بنابراین با افزودن يکبار آنزيم Taq پليمراز ديگر نيازی به اضافه کردن مجدد آن نیست و PCR براحتی و به صورت اتوماتيک انجام می شود. در حال حاضر Taq پليمراز برای تکثیر قطعات کمتر از سه هزار جفت باز توصیه شده و پر مصرف ترین آنزیم مورد استفاده در PCR می باشد. به طور معمول حدود یک واحد از این آنزیم در 50 میکرو لیتر از واکنشPCR استفاده می شود. اگر نمونه DNA حاوی مواد ممانعت کننده PCR باشد، می توان این مقدار را دو تا سه برابر افزایش داد ولی مقادیر بالاتر آنزیم باعث تولید محصولات غیر اختصاصی می گردد. مزيت بسيار مهم ديگر Taq پليمراز افزايش حساسيت و دقت PCR می باشد. در دمای پايين (30 درجه سانتی گراد که برای DNA پليمراز E.coli بکار می رفت) پرايمرها ممکن است به جايگاههايی که توالی تا حدودی مشابه دارند نيز متصل شوند، زيرا در دمای پايين تعداد کمتری پيوند هيدروژنی برای اتصال پرايمرها نياز است. بنابراين پرايمرها با اتصال به نواحی نسبتاَ مشابه، باعث ايجاد اشتباه در انجام مراحل PCR می شوند. ولی وقتی که واکنش در دمای 72 درجه (دمای اپتيمم فعاليتTaq پليمراز انجام شود اتصال پرايمرها به نواحی غير از ناحیه ی اصلی کاهش می يابد. به اين صورت پس از پايان PCR رشته های DNA کاملاَ مشابه و خالص بدست خواهد آمد.

پروتکل عمومی PCR

واکنشگر ها:

پرایمر پیشرو و معکوس
DNA پلیمراز
DNA الگو
دزوكسي نوكلئوتيد تري فسفات (dNTPs)

نکته: از ابتدای آزمایش PCR تا پایان، همیشه باید دستکش بپوشید تا از آلودگی DNA جلوگیری شود. تمام واکنشگر هل، پرایمر ها و آنزیم ها باید در یخ نگه داشته شوند. قبل از شروع آماده سازی محلول PCR اطمینان حاصل کنید که پرایمرها، الگوی DNA، بافر کاملاً منجمد شده اند. ایجاد یک طرح آزمایشی مطابق با دستورالعمل های علمی از جمله کنترل مثبت و یک کنترل منفی مهم است. به عنوان کنترل منفی، می توانید PCR را بدون الگوی DNA تهیه کنید. برای کنترل مثبت شما باید از مجموعه پرایمر ها و الگوی DNA استفاده کنید که نشان دهد آزمایش های انجام شده به درستی عمل کرده.

بسته به DNA پلیمراز مورد استفاده، غلظت نهایی هر واکنشگر متفاوت خواهد بود. اینجا حجم و غلظت استاندارد با در نظر گرفتن یک واکنش50 میکرولیتری است:

در لوله های PCR 200 میکرولیتری:

38 میکرولیتر آب بدون نوکلئاز اضافه کنید
2 میکرولیتر پرایمر پیشرو (10 میکرومولار) اضافه کنید
2 میکرولیتر پرایمر معکوس (10 میکرومولار) اضافه کنید
1 میکرولیتر از dNTP ها (50 میکرومولار) اضافه کنید
5 میکرولیتر از بافر واکنش حاوی MgCl2 (10X) اضافه کنید
1 میکرولیتر از الگوی DNA (ng/μl100) اضافه کنید
1 میکرولیتر DNA پلیمراز (U/μl 0.5) اضافه کنید

نکته: اگر شما میخواهید تعداد قابل توجهی از واکنشهای PCR را انجام دهید، توصیه می شود یک ترکیب واکنش را تهیه کنید، به استثنای واکنشگر هایی که در آزمایش های مختلف متفاوت است (معمولاً الگوی DNA یا مجموعه پرایمر ها).

با استفاده از پیپت به آرامی ترکیبات را مخلوط کنید تا به خوبی همگن سازی شود.
توصیه میشود با تعداد دور کم سانتریفیوژ کنید.
مطمئن شوید که درپوش های لوله های PCR بسته اند.
لوله را در دماسنج قرار دهید.

نکته: قبل از آماده شدن واکنش PCR ، تنظیمات PCR مانند دما ، زمان و چرخه ها را تنظیم کنید.

مراحل PCR

1- مرحله دناتوراسیون:

دناتوراسیون اولیه به مدت 30 ثانیه در دمای 95 درجه سانتیگراد برای اکثر آمپلیکون های الگوهای DNA خالص کافی است. برای الگوهای سخت تر مانند توالی های غنی از GC، دناتوراسیون اولیه طولانی تر از 2-4 دقیقه توصیه می شود تا الگو کاملاً از بین برود.

2- مرحله اتصال:

مرحله اتصال معمولاً 15-60 ثانیه است. دمای اتصال بر اساس Tm جفت پرایمر است و به طور معمول 45-68 درجه سانتی گراد است. دمای اتصال در حدود ۳ الی ۵ درجه پائین تر از نقطه ذوب پرایمرها است. PCR از نظر اصول عملی تشابه زيادی به همانند سازی DNA بر اساس قوانین معروف واتسون- کریک دارد و در واقع برگرفته از آن است. همیشه A با T و G با C جفت می شود. بنابراین پیوندهای هیدروژنی پایدار فقط زمانی شکل می گیرد که سکانس پرایمر و رشته الگو مکمل یکدیگر باشند و رشته الگو همیشه توالی بازی رشته مقابل را تعیین میکند.

3- مرحله طویل شدن یا پلیمریزاسیون:

دمای پلیمریزاسیون توصیه شده 68 درجه سانتی گراد است. زمان های پلیمریزاسیون به طور کلی 1 دقیقه در هر هزار باز است.

4- تعداد چرخه ها:

بعد از اين 3 مرحله، چرخه اول تمام مي‌شود و چـرخـه ‌هاي بعدي تكرار چرخه اول است. چون در مرحله ی قبل رشته DNA در ناحيه مورد نظر مضاعف شده است، در اين مرحله چهار رشته ی الگو برای همانند سازی وجود دارد. بار ديگر سيستم گرم می شود و در اينجا هشت نسخه بوجود مي آيد، و در مرحله ی بعد 16 نسخه و به همين صورت به دنبال چرخه‌هاي متعدد قطعه DNA مورد نظر به طور تصاعدي و به نسبتn2 افزایش می یابد که n تعداد سیکل های دمایی است. به طور مثال یک مولکول DNA، پس از ۲۰ سیکل به ۱٫۰۴۷٫۵۸۶ مولکول تکثیر می شود. تعداد سیکل ها با توجه به مقدار DNAی اولیه، شرایط آزمایش و مقدار محصول مورد نیاز انتخاب می شود. لازم به ذکر است که DNA های کوتاه (Short target product) یعنی رشته هایی که بین دوپرایمر محصور هستند بصورت تصاعد هندسی (exponential) و DNA های بلند (long target product) یعنی رشته هایی که از یک طرف توسط یک پرایمر محدود هستند و از سمت دیگر نامحدود می باشند بصورت تصاعد حسابی (linearly) زیاد می شوند.

5- مرحله طویل شدن نهایی (Final elongation)

این مرحله، پس از آخرین سیکل PCR، به مدت ۵ الی ۱۵ دقیقه در دمای ۷۰ الی ۷۴ درجه انجام می شود، تا اطمینان حاصل شود که همه تک رشته های DNA همانند سازی شده اند. دمای لوله ها و فواصل زمانی تابع عوامل مختلفی از جمله نقطه ذوب پرایمرها (Tm)، نوع DNA پلیمراز، غلظت یونهای دو ظرفیتی و غلظت dNTPها است.

6- نگهداری نهایی (Final hold)

در این مرحله، محلول نهایی به مدت کوتاهی در دمای ۴ الی ۱۵ درجه قابل نگهداری است.

7- ردیابی (detect) محصول PCR

نهایتا می توان صحت انجام PCR را از طریق الکتروفورز در ژل آگارز یا پلی اکریلامید، هیبرید شدن محصول PCR با الیگو نوکلئوتید نشاندار (پروب)، الکتروفورز نمودن همراه با مارکر وزن مولکولی(DNA lader که حاوی قطعات DNA با اندازه های مشخص است) و یا رنگ آميزی اتيديوم برومايد بررسی نمود.

تهیه و تنظیم مهدی ادریسیان (دانشجوی کارشناسی رشته سلولی و مولکولی دانشگاه شاهد)